Santa Cruz公司產品Protocols及相關支持產品

Santa Cruz生物技術公司為*抗體提供了高品質的支持產品。包括用于WB和IHC的自產的第二抗體， 用于IP研究的發光試劑，瓊脂糖標記proteinA，proteinG PLUS和proteinL，用于WB的胞核提取，全細胞溶解物，組織提取試劑，WB膜，TransCruz凝膠遷移寡核苷酸，封閉物和實驗室常用試劑。 提供用于WB的Cruz MarkerTM分子量標準和預染分子量標準。ImmunoCruz染色系統用于IHC（石蠟切片）染色，為預稀釋，即用系統。還介紹一系列凋亡檢測試劑 盒。支持產品主要涵蓋以下方面：1）WB 2）IP 3）IP/WB 4）免疫復合蛋白激酶檢測 5）免疫過氧化物酶細胞染色 6）免疫熒光細胞染色 7）流式細胞技術（FCM）8）ELISA檢測 9）TransCruz凝膠超遷移實驗 10）用多肽中和抗體活性的方法 11）染色質免疫沉淀（ChIP）實驗 12）siRNA轉染 13）半定量RT-PCR 14）溶液配制。

1. WB

A.樣品準備
注意：細胞培養基產品包括經典和特殊培養基，血清，培養基添加物，誘導物，抗生素。產品列表請登陸www.scbt.com。

單層細胞

室溫下，移去培養基并用PBS沖洗直徑100mm的培養皿。以下步驟均在冰上或4℃操作，使用冰預冷的新鮮緩沖液。
加入0.6ml RIPA裂解液（sc-24948）。4℃輕輕晃動細胞培養皿15min。用細胞刮將貼壁細胞刮下。轉移裂解液至微量離心管內。

用0.3ml RIPA裂解液洗一次培養皿，將洗液與之前的溶解物合并。（可選擇：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）儲存液和/或用21號注射器針頭切割DNA）冰上孵育30-60min。
將細胞溶解物4℃離心，10000×g，10min。轉移漢細胞裂解物的上清至新的離心管內，棄沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究時，可用PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集純化細胞溶解物中的磷酸化蛋白。

懸浮細胞
室溫低速離心5min，收集約2.0×107個細胞。小心除去培養基。
室溫下用PBS沖洗細胞沉淀，再次低速離心5min，小心除去培養基。
加入1.0ml冰預冷的RIPA裂解液（sc-24948），裂解液中現用現加入蛋白酶抑制劑和/或磷酸酶抑制劑。用移液器輕輕懸浮細胞，冰上孵育30min。
 用21號注射器針頭、杜恩斯勻漿器或超聲進一步破壞使細胞均質化。注意不要使裂解物溫度過高。（可選擇：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）儲存液。）冰上孵育30min。
將裂解液轉移至離心管，4℃離心，10000×g，10min。轉移上清至新的離心管內，棄去沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究時，可用PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集純化細胞溶解物中的磷酸化蛋白。

組織樣品
稱重組織塊，并用干凈的剃刀剪碎。冰凍組織可被切的很薄，并在含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（sc-24948）中解凍。3ml冰預冷的RIPA/g組織。
杜恩斯勻漿器或超聲進一步破壞使細胞均質化，溫度維持在4℃。（可選擇：加入30μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）儲存液/g組織。）冰上孵育30min。
將裂解液轉移至離心管，4℃離心，10000×g，10min。棄沉淀。可加長離心時間獲得更好的裂解產物。

注意：涉及磷酸化作用研究時，可用PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集純化細胞溶解物中的磷酸化蛋白。

B電泳

將樣品（每個泳道全細胞提取物40-60μg，胞核提取物10-20μg或10-20ng純化蛋白）與等體積2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）混合，煮沸2-3min。未用完的樣品可保存在-20℃。
上樣，10μl/1.0mm×0.75mm孔。
推薦使用Cruz MarkerTM分子量標準（sc-2035）。小膠（0.75mm）每孔上樣2μl，大膠（1.5mm）每孔上樣5μl。如用與Cruz MarkerTM一致的第二抗體，可看到用于檢測試劑的內參條帶。也可選擇預染分子量標準（sc-2361）。
電泳步驟參考標準protocols。
根據廠家protocols，用電轉裝置將蛋白條帶轉移至NC膜或PVDF膜上。

注意：Cruz Blot SystemTM提供預制好的人或小鼠全細胞提取物和核提取物，或小鼠組織提取物。

C.Immunoblotting
用Blotto（BlottoA或B；用抗牛第二抗體時建議使用BSA）封閉膜上的非特異位點，室溫孵育30-60min。也可選擇用不含Tween-20的Blotto，在封閉容器內4℃過夜孵育。
如果使用的是磷酸化特異抗體，建議向封閉液和抗體稀釋液中加入50 mM NaF（NaF：sc-24988）抑制磷酸化酶。
封閉好的膜與*抗體（Blotto稀釋）稀釋液室溫孵育1小時。（如果是磷酸化特異抗體，要用加了50 mM NaF的Blotto稀釋液。）抗體*濃度根據滴度決定。建議起始稀釋度為0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次，5min/次。
將 膜與HRP或AP標記的第二抗體稀釋液（Blotto稀釋）室溫孵育45min，稀釋度1:500-1:2000。如果背景過高，第二抗體需進一步稀釋 （可達1:20000）。作ECL時，如果使用Cruz MarkerTM分子量標準（sc-2035），必須使用Cruz MarkerTM compatible secondary antibody作為可視化標準。
TBST洗膜3次，5min/次，然后TBS洗膜一次，5min。
將膜與化學發光試劑（sc-2408）孵育。如果發光化合物用于可見光檢測，必須用HRP標記的第二抗體。

2．IP

注意：本操作步驟可用于放射性或正磷酸鹽標記的細胞。（放射性物質的使用及處理應遵循適當的條例如OSHA和 NRC指導手冊。）細胞標記必須在無待標記氨基酸殘基或無磷酸鹽的培養基中進行。建議標記前使細胞處于適當的饑餓狀態。孵育培養細胞（100mm細胞培養 皿上約80-90%
單層細胞匯合或培養瓶內含約2-5×107個懸浮細胞）。通常，用傳代貼壁細胞或2-5×107個懸浮細胞可得到*標記。

例如：除去培養基，加入含5%透析胎牛血清和100μCi/ml35S-蛋氨酸的無蛋氨酸培養基。37℃孵育1h。某些蛋白需延長標記時間（18hrs）。有必要用PBS洗滌細胞除去未結合的放射物。

向單層傳代細胞中加入1-3ml冰預冷的RIPA（sc-24948），4℃孵育10min。對于懸浮細胞則向離心管中加入RIPA洗滌細胞沉淀。
用21號注射器針頭或超聲波反復裂解細胞。轉移裂解物至微量離心管中。
可選擇：用1.0ml冰預冷的RIPA沖洗細胞培養皿，與之前的合并處理。
4℃，10000×g離心10min。冰上轉移上清（細胞溶解液）至新的微量離心管。
預處理細胞溶解液，加入1.0μg的control IgG（與*抗體的種屬來源一致）和20μl懸浮的（25%v/v）瓊脂糖偶聯物（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。4℃孵育30min。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。
轉移上清或約100-1000μg總細胞蛋白至微量離心管中。加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應滴定測定），4℃孵育1-2hrs。或者，可加入20μl*抗體瓊脂糖偶聯物，混勻，4℃孵育1hr-過夜；跳過下一步驟。
加入20μl適當的瓊脂糖偶聯物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過夜。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。
用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復以上離心步驟。
zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。
樣品煮沸2-3min，上樣電泳分離免疫復合物，通過放射自顯影觀察結果。未用完的樣品可保存在-20℃。
可選擇：煮沸后，樣品可經離心沉淀瓊脂糖顆粒，然后SDS-PAGE分析上清。

3．IP/WB

按照之前描述的WB程序準備總細胞溶解物。

注意：如進行磷酸化研究，溶解物可用Santa Cruz的PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集磷酸化蛋白。 

預處理全細胞溶解物（可選擇步驟），約1ml全細胞溶解物或組織提取物，加入0.25μg適當的control IgG（與*抗體種屬來源一致）和20μl懸浮的（25%v/v）瓊脂糖偶聯物（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂 糖）。4℃孵育30min。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。轉移上清（細胞溶解物）至干凈的微量離心管。
1ml細胞溶解物或約100-1000μg總細胞蛋白，加入10μl*抗體瓊脂糖偶聯物，混勻，4℃孵育1hr-過夜。
可 選擇：如無*抗體瓊脂糖偶聯物，1ml細胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應滴定測定），4℃孵育1-2hrs。加入 20μl適當的瓊脂糖偶聯物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過夜。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。
用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復以上離心步驟。
zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。
樣品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上樣孔上樣5-10μl。
電泳并按WB程序作免疫雜交。

注意：選擇不同的第二抗體，55kDa重鏈和27kDa輕鏈IgG，可檢測到*抗體。如果以上步驟中采用*抗體瓊脂糖偶聯物則*抗體條帶不明顯。

4．免疫復合蛋白激酶測定
從100mm細胞培養皿（單層細胞80-90%匯合）移除培養基，PBS洗一次。
加入1-3ml冰預冷的RIPA裂解緩沖液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解緩沖液對某些激酶效果不好。需要優化裂解液成分來保持激酶活性。）
用21號注射器針頭反復抽吸使細胞破碎充分，轉移至15ml離心管中。
用1ml冰預冷的RIPA裂解緩沖液，0.5%Triton X-100（sc-29112）沖洗培養皿，與原裂解液合并。
10000×g，4℃離心10min。4℃轉移上清至新的離心管內。
轉移1.0ml細胞提取物（上清）至1.5ml離心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）*抗體（抗體*濃度經滴定測定），4℃孵育1hr。
加入20μl適當的瓊脂糖偶聯物懸浮液（（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好蓋子，4℃振搖孵育1hr-過夜。
2500rpm（約1000×g），4℃離心5min，收集免疫沉淀復合物。小心吸棄上清。
1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重復上述離心步驟。
 20μl 適當的蛋白激酶緩沖液重懸沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巰基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。緩沖液成分根據所研究的激酶調整。
加入10-1000ng多肽底物。該底物/酶/細胞系的多肽底物濃度應根據經驗決定。
準備1ml ATP混合物：930μl適當的蛋白激酶緩沖液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl2和44μl [γ32P]-ATP[10mCi/ml]。每個樣品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。
加 入等體積2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）終止反應，樣品煮沸2-3min。樣品可離心沉淀瓊脂糖微珠（可選擇）；分析上清。跑SDS-PAGE， 通過放射自顯影觀察結果。未用完的樣品保存在-20℃。檢測中如用小肽底物，樣品必須通過閃爍計數或其他標準方法而不是SDS-PAGE來分析。

5．免疫過氧化物酶細胞染色

A． 組織培養細胞

在無菌的蓋玻片上培養細胞37℃過夜。PBS簡單沖洗后按以下程序之一固定細胞：
1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推薦方法）；或
2）冰丙酮2min，自然干燥；或
3）1%甲醛-PBS 10min（保持濕潤）。
PBS洗三次。
可選擇：含0.1-1%*的PBS孵育5-10min，淬滅內源過氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

B．冰凍組織切片

冰凍組織存放于液氮中。切片前（2周）可保存于-70℃。
95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干。或使用預處理的玻片。
切片厚度4-10μm。室溫貼片。切片保存在-70℃。固定染色前室溫解凍切片。

注意：免疫組化切片固定劑清單包括Clarion和Crystal固定劑。

冰丙酮固定切片10min，冷藏。PBS洗三次。
可選擇：含0.1-1%*的PBS孵育5-10min，淬滅內源過氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。
注意：組織內有豐富的生物素（引起高背景染色），建議甲醛固定，遵循石蠟包埋組織切片protocol，因為石蠟包埋組織中內源性生物素被破壞。

C． 甲醛固定，石蠟包埋組織切片

按標準程序甲醛固定，石蠟包埋組織。
95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干。或使用預處理的玻片。
切片厚度4-6μm。二甲苯脫蠟，3次，5min/次。依次過梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去離子水浸洗1min。甩去切片上多余的液體。

可選擇：可做抗原修復。甲醛固定和石蠟包埋導致某些抗原決定簇被封閉，可按以下方法修復暴露抗原位點：

i. 熱修復（推薦方法）：切片浸沒入10mM檸檬酸鈉緩沖液（sc-29109），pH6.0；或浸沒入含0.01% （w/v）EDTA（sc-29092）的50mM甘氨酸-HCl緩沖液（甘氨酸：sc-29096）中，pH3.5。95℃加熱5min。換新的緩沖 液，95℃加熱5min。（不同組織類型*孵育時間不同）。將切片放入緩沖液中冷卻約20min。用去離子水洗3次，2min/次。甩干切片。
ii. 胃蛋白酶：切片用含0.1%胃蛋白酶的0.01N HCl室溫孵育10-20min。去離子水沖洗幾次，甩去多余液體。
iii. 皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去離子水室溫孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液體。

可選擇：切片在含0.1-1%*的去離子水中孵育5-10min，淬滅內源過氧化物酶活性，PBS洗2次，5min/次。

注意：組織內有豐富的生物素（引起高背景染色），建議甲醛固定，遵循石蠟包埋組織切片protocol，因為石蠟包埋組織中內源性生物素被破壞。

D．免疫過氧化物酶染色

切片的免疫酶染色，建議用Santa Cruz的ABC染色試劑盒或ImmunoCruzTM染色試劑盒。ABC染色試劑盒利用親和素-生物素化辣根過氧化物酶復合物作為檢測物；而 ImmunoCruzTM染色試劑盒利用鏈親和素辣根過氧化物酶復合物作為檢測物，該體系包括所有預稀釋好的第二抗體，即用型，也包括預稀釋的*抗體。 所有染色體系中均有完整的protocol；以下為簡化版protocol。
所有反應步驟均于室溫下濕盒內完成。使用前試劑盒試劑要先恢復至室溫。操作中切片不能過干。每步操作完用吸引管吸除試劑，避免切片過干。要用足夠的反應液覆蓋標本（通常100μl/張切片就足夠了）。

ABC染色試劑盒

PBS稀釋的1.5%封閉血清孵育1hr。理想的封閉血清和第二抗體為同種屬來源。從切片上去除封閉血清。
滴加*抗體室溫孵育30min或4℃過夜孵育。抗體*反應濃度需經滴定確定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。
滴加預稀釋的生物素化第二抗體或用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至1μg/ml的生物素化第二抗體，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
滴加親和素生物素酶反應物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
用提供的過氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出現理想染色止。注意監控單張切片的恰當顯色時間。去離子水洗5min。可用蘇木素（sc-24973）復染5-10s。迅速用去離子水洗幾次。
梯 度酒精，二甲苯依次脫水：浸沒入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，zui后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加 1-2滴封片固定劑（如Clarion，sc-24942），蓋上蓋玻片（sc-24975），光學顯微鏡下觀察。

ImmunoCruzTM染色試劑盒

滴加1-3滴血清封閉液孵育20min。甩去封閉液。
迅速加入1-3滴預稀釋的*抗體。如果所用染色系統不含預稀釋的抗體，就把*抗體用血清封閉液稀釋至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS沖洗，然后切片浸沒入PBS內洗2次，2min/次。甩去多余的液體。
滴加1-3滴生物素化第二抗體，孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP-鏈親和素復合物，孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP底物混合物。顯色30s-10min，或直至出現理想染色止。去離子水沖洗，然后切片浸沒入去離子水內洗2次，2min/次。
復染，脫水，封片。（同ABC染色試劑盒）

6．免疫熒光細胞染色

切片準備同免疫酶染色，省去包括*處理細胞在內的zui后一步。
每步操作完吸除反應液，但要避免樣品過干。用足夠的反應液覆蓋樣品（100-500μl/張切片）。
滴加含10%封閉血清-PBS，孵育20min，減少和IgG結合的非特異位點。理想的封閉血清和第二抗體為同種屬來源。從切片上去除封閉血清。
滴加*抗體，孵育60min。抗體*反應濃度應滴定決定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml，PBS洗3次，5min/次。
滴加生物素標記或熒光染料標記的第二抗體（用含1.5%-3%封閉血清的PBS稀釋至1-5μg/ml），孵育45min。PBS洗3次。如果使用熒光染料標記的第二抗體，須暗室孵育，并省略下步。
滴加鏈親和素-熒光素，暗室孵育15min。鏈親和素標記物濃度需經滴定決定；建議PBS稀釋至10-20μg/ml。PBS充分洗凈。
用水相固定劑或90%甘油PBS溶液封片。
選擇適當的濾鏡在熒光顯微鏡下觀察。室溫避光保存切片（UltraCruzTM固片劑：sc-24941）或保存在4℃（甘油/PBS固片劑）。

7．流式細胞儀技術

細胞表面染色

準備細胞
1） 溶解血紅細胞。（注意：準備足夠的細胞用于10份樣品100μl/份檢測）。
1ml全血加入14ml恢復至室溫的1×FCM溶解液（sc-3621）中。
輕輕混勻，室溫孵育3-5min。不要超過5min。
離心5min，棄上清，預冷的5ml 1×PBS輕輕重懸沉淀。
離心5min，棄上清，預冷的1ml 1×PBS輕輕重懸沉淀。
2）準備培養細胞。（注意：本protocol通常處理50ml培養細胞。單層細胞，切勿胰酶消化！用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗細胞1次。）
血球計數儀計數細胞。
1000rpm離心5min，棄上清，用足夠的1×PBS輕輕重懸沉淀至終濃度為1×107細胞/ml。

各管加入熒光染料標記的*抗體或isotype control。（20μl/106細胞。滴定抗體確定*濃度）。
每管加入100μl RBC溶解的全血或單細胞懸液。混勻，放在有蓋的冰盒內孵育15-30min。
每管加入1.5ml FCM沖洗緩沖液（sc-3624），顛倒混勻。1000rpm離心5min，棄上清，500μl 1%多聚甲醛重懸沉淀。
測讀分析數據。

細胞內染色

可用適當的活性物質刺激細胞。確保有未刺激細胞對照。
50ml離心管收集細胞。2000rpm離心5min，棄上清。
室溫1×PBS 20ml重懸細胞。
細胞計數。
2000rpm離心5min除去PBS。4℃1×PBS洗1次。2000rpm離心5min除去PBS。
每106個細胞加入1ml 4℃ FCM固定緩沖液（sc-3622），冰育15-30min。
4℃1×PBS洗細胞2次，離心，棄上清。
每106個細胞加入1ml -20℃ FCM滲透緩沖液（sc-3623），逐滴加入混懸。冰育15min。
離心；4℃ FCM沖洗緩沖液（sc-3624）。
2000rpm離心5min，棄上清。每107個細胞加入1ml FCM沖洗緩沖液，然后等分細胞（106）至各待測管中。
細胞內著染：各管加入熒光染料標記的*抗體或isotype control。室溫避光孵育1hr。

注意：為得到*結果應滴定熒光染料標記抗體。

1ml FCM沖洗緩沖液洗細胞2次， 500μl新鮮FCM沖洗緩沖液重懸。
24hrs內檢測分析。

8．ELISA檢測

包被微孔板，靶蛋白用50mM碳酸鹽包被液（pH9.0）稀釋。*包被濃度須經滴定，但純化抗原通常為1μg/ml，50μl/孔。封好，4℃過夜孵育。
棄凈液體。加入200μl/孔封閉液（含1%BSA和0.02%疊氮鈉的PBS）封閉非特異結合位點。室溫孵育1-2hrs或4℃過夜孵育。
棄凈液體。含0.02%疊氮鈉的PBS洗1次。濕潤的微孔條可用塑料密封袋密封，4℃保存4周。用前，棄凈多余的液體。
加入50μl/孔封閉液稀釋的待測樣品和對照。抗體需梯度稀釋測定滴度或用以前的工作濃度作篩選或半定量。室溫孵育1hr。
含0.05%Tween-20（sc-29113）的PBS洗板3次，棄凈液體。
加入50μl/孔封閉液稀釋的1:100-1:1000的堿性磷酸酶標記抗體。*抗體濃度需滴定決定。室溫孵育1hr。
棄凈液體。含0.05%Tween-20的PBS洗板3次，拍干，棄凈液體。
乙醇胺緩沖液（10mM乙醇胺，0.5mM MgCl2（sc-29098），pH9.5）洗1次，棄凈液體。
用乙醇胺緩沖液稀釋底物（PNPP，sc-3720）至終濃度1mg/ml。加入50μl/孔。反應10-20min直到陽性對照OD405/490讀數達1.0。加入50μl/孔0.1M EDTA，pH7.5終止反應。OD405/490讀數。

9、TRANSCRUZTM 超凝膠遷移檢測

用多聚核苷酸激酶將[γ32p]-ATP 標記到寡核苷酸上，達到50,000cpm/ng
準備膠遷移緩沖液：10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油
準備20ul的反應混合物，將3-10ug核抽提物，和1ug多聚dIdC溶解在20ul膠轉移緩沖液中。加0.5ng標記的寡核苷酸探針，室溫孵育20分鐘。這組成了檢測DNA-蛋白復合物的對照樣品
為了檢測抗體遷移或封閉DNA-蛋白復合物，按步驟3準備反應混合物，每20ul反應體積加1-2ul TransCruzTM 超凝膠遷移抗體。一般是在加了探針之后，才加抗體，但在加探針前加入抗體，可使結果加強
通過4% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（25-30ma）,分開DNA和蛋白復合物。凝膠中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待膠干后，自動放射顯影查看結果

10、肽的中和

對所有的santa cruz的親和純化的兔或山羊的多抗和單抗，都有相應的封閉肽做對照。通過將抗體和封閉肽的預先孵育，抗體對抗原的結合可以被阻止。
決定zui高的抗體稀釋度，在這個稀釋度下，可以一直獲得理想的陽性結果。例如，H-Ras在免疫沉淀時，推薦的濃度是1ug/ml,但陽性結果是在50ng/ml。
封閉/競爭時，將抗體（抗體濃度按照以前提到的方法確定）和5倍重量的封閉肽混合在500ul的PBS中，室溫孵育2小時，或4度過夜。
封閉/競爭后，用封閉緩沖液稀釋抗體/封閉肽混合物，然后，按照所期望的實驗的操作進行。

11，染色質免疫沉淀

注意：CHIP的實驗步驟可以有很多不同版本，下面介紹的步驟適合大多數的實驗
常溫下，用PBS洗細胞，重懸細胞，使細胞數大約5*105個/ml（總細胞數2*107）。,
加甲醛，使終濃度為1%，室溫孵育10分鐘。
加甘氨酸至終濃度0.125M，終止交聯反應
2000rpm,5分鐘，離心細胞。用冷的PBS洗細胞一次
用6ml的裂解緩沖液重懸細胞，輕柔混合，2000rpm離心5分鐘，收集粗提的核提取物。
再用PBS洗沉淀，沉淀可以凍存，或繼續以下步驟。
用1.9ml的高鹽裂解緩沖液重懸沉淀，轉移到2ml的離心管中準備超聲
超聲條件需要優化，下面介紹的條件是在使用Sonics VC130和3mm的探頭的基礎上建立起來的：
在冰上操作，輸出功率設置5（R）6,每隔30秒超聲一次，共4次。
4°C，10，000rpm 離心15分鐘，保存上清，確定上清中蛋白的濃度。
如果免疫沉淀，我們推薦100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz試劑（0.2—2ug）
注意：研究者可能希望使用連接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于選擇后續免疫沉淀的試劑。有些情況下，將針對同一種蛋白不同表位的抗體聯合使用會更好。
向染色質溶液加50ul Protein A/G-瓊脂糖，4度，孵育30分鐘，使其澄清，zui大速度，4度離心5分鐘。
向上清中加一抗，4度孵育過夜。
加50ul Protein A/G –瓊脂糖，4度孵育2小時。
12，000rpm離心20秒收獲磁珠，并將管放在冰上
用1ml裂解緩沖液洗磁珠2次
用沖洗緩沖液洗磁珠四次
重懸磁珠在400ul洗脫緩沖液中
通過在67度水浴中孵育管子2小時以上，使反向交叉連接
離心去除磁珠，繼續在67度水浴孵育上清過夜 Remove
10,000rpm離心3分鐘去除殘留的珠子，保留上清
分離DNA,用500ul 酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提上清,劇烈振蕩，14,000rpm離心3分鐘分離兩相。
保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 （TE）  反向抽提有機相一次，在匯集水相
用600ul 氯仿/異戊醇抽提匯集的水相
DNA可以用商業化的試劑盒濃縮。

12. siRNA小干擾RNA

轉染
*天：準備細胞
健康的細胞是成功轉染的要求，在轉染前明確細胞的生存狀態
對于貼壁細胞：
1，吸棄培養基，用胰蛋白酶、EDTA、或其他合適的方法分散細胞，在胰蛋白酶化前，用無菌的1X PBS漂洗細胞2次。
2，一旦細胞分散，用4倍體積的含10% 胎牛血清不含抗生素的生長培養基（如DEME,RMPI1640）稀釋懸浮液 。
（注意：這個階段使用不含抗生素的培養基是轉染成功的關鍵）
3，1,000 rpm離心5分鐘，去除培養基，用不含抗生素的培養基重懸沉淀
4，轉移細胞到12孔的細胞培養板 以便細胞過夜培養后，細胞覆蓋率達60-80%
（注意：細胞覆蓋率也是成功轉染的關鍵）
對于懸浮細胞：
1，1,000 rpm離心5分鐘
2，去除培養基，用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培養基重懸沉淀
3，轉移細胞到12孔的細胞培養板或轉到多聚賴氨酸包被的8孔板中，以便細胞過夜培養后，細胞覆蓋率達60-80%
（注意：多聚賴氨酸包被是使懸浮細胞黏附到板底必須的）
第二天
 準備轉染試劑和轉染
 注意：對于不同的實驗目的有不同的操作步驟，請根據試驗需要選擇下面介紹的操作步驟。
對于蛋白和轉錄檢測
注意：當在組織培養板中進行不同劑量的siRNA轉染時，轉染試劑和siRNA轉染培養基的用量需要與不同孔的表面積成比率。
1，對每一次轉染，在一個無菌的小管里準備下面的混合物 這一步無關細胞培養類型
 （A） 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA轉染培養基中，輕柔混合，在室溫中放置15分鐘 （注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液進行稀釋）
（B）加2.4ul siRNA轉染試劑到40ul的siRNA轉染培養基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。
注意：雖然siRNA轉染試劑對許多細胞都有很高的轉染效率，但并不是適用于所有的細胞
 2， 5分鐘后，混合A和B形成siRNA-siRNA轉染試劑混合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。
 3， 然后，向每個含有siRNA-siRNA轉染試劑混合物的管中加入0.32ml的siRNA轉染培養基，輕柔混合
對貼壁細胞：
    4.1轉染前，吸棄培養基，用1ml無菌siRNA轉染培養基洗細胞一次，棄培養基。
4.2在洗過的細胞上，鋪稀釋的siRNA-siRNA轉染試劑混合物，37度，5-7小時
4.3孵育后，向含有轉染細胞的每個孔中加0.4ml 生長培養基，其中的血清和抗生素濃度是正常濃度的兩倍，無需去除轉染混合物。如果，毒性是個問題的話，去除轉染混合物，以正常生長培養基代替。再孵育18-24小時
4.4孵育結束后，用新鮮正常生長培養基替換，繼續孵育24-72小時
4.5從細胞中吸棄培養基，用1ml 1*PBS洗細胞一次，然后丟棄
4.6放置在冰上，向孔中加入300ul 1*電泳緩沖液，用移液器吹打，混勻。（注意：混合物可能變得粘稠）
如果進行Western blot的話，轉移混合物到15ml的錐形管中，放在冰上，對混合物進行超聲波降解，每15秒一次，用輸出功率的40%。如果，超聲后，起很多泡泡，1000轉/秒，離心3分鐘，然后，按照western blot的方法進行電泳，免疫印跡。
如果做轉錄分析，按照我們的半定量RT-PCR的操作進行。
對懸浮細胞
4.1在轉染前，1000轉/秒， 離心5分鐘收集細胞。去除培養基，用1ml 無菌的siRNA轉染培養基 。
4.2 再次離心1000轉/秒，5分鐘，去除培養基。用稀釋的siRNA-siRNA轉染試劑復合物重懸細胞。轉移細胞到12孔組織培養板，37°C孵育5-7小時，每次單獨轉染時重復。
4.3孵育后，加0.4ml含2倍正常血清和抗生物濃度的生長培養基到每個含被轉染細胞的孔中，不要去除轉染混合物。如果有毒性的話，去除轉染混合物，代替以正常生長培養基，在額外孵育18-24小時。
4.4一旦孵育結束，離心細胞，去除培養基。用新鮮的正常生長培養基重懸細胞。轉移細胞到12孔組織培養板，繼續孵育24-72小時。
如果  需要做western blot分析，則繼續以下步驟
轉 移混合物到15ml的錐形管中。將2*電泳上樣緩沖液用Milli-Q超純水稀釋到1* 。1000轉離心5分鐘，收集細胞，去除培養基，用1ml PBS洗細胞，重復一次，用300ul 1*電泳上樣緩沖液重懸細胞，放在冰上，對混合物進行超聲波降解，每15秒一次，用輸出功率的40%。如果，超聲后，起很多泡泡，1000轉/秒，離心3 分鐘，然后，按照western blot的方法進行電泳，免疫印跡。
如果需要轉錄分析，參照半定量RT-PCR步驟。

免疫熒光檢測
注意：當在組織培養板中進行不同劑量的siRNA轉染時，轉染試劑和siRNA轉染培養基的用量需要與不同孔的表面積成比率。
1，準備以下混合物：
（A）加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA轉染培養基中，輕柔混合，在室溫放置5分鐘  注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液稀釋
（B） 加1.2ul siRNA轉染試劑到20ul siRNA轉染培養基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。注意：雖然，對多種的細胞系有很高的轉染效率，但siRAN轉染試劑并不是對所有細胞都適合。
2，5分鐘后，混合A和B，形成siRNA-siRNA轉染試劑復合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。
3，孵育后，加160ul siRNA轉染培養基到每個含有siRNA-siRNA轉染試劑復合物的管中，輕柔混合
  從這一步起，對懸浮細胞和貼壁細胞的處理方法相同
4，轉染前，吸棄培養基，用0.3ml無菌siRNA轉染培養基洗細胞一次，去除培養基。
5，在洗過的細胞上，鋪稀釋的siRNA-siRNA轉染試劑混合物，37度，5-7小時
6，孵育后，向含有轉染細胞的每個孔中加200ul 生長培養基，其中的血清和抗生素濃度是正常濃度的兩倍，無需去除轉染混合物。如果，毒性是個問題的話，去除轉染混合物，以正常生長培養基代替。再孵育18-24小時
7,孵育結束后，用新鮮正常生長培養基替換，繼續孵育24-72小時
8,使用恰當的操作步驟檢測細胞，參見免疫熒光染色步驟

13，半定量RT-PCR

cDNA合成
準備試劑：1ul oligo（dT） 12-18（500 µg/ml）
1 ng-5 µg 總 RNA
1 µl 10 mM dNTPs
用不含RNA酶的去離子水補加到總體積12 µl
70℃ 孵育 5 分鐘，迅速放在冰上，再加入
4 µl 5x反轉錄酶緩沖液
2 µl 0.1 M DTT
1 µl RNase 抑制劑
42℃孵育 2 分鐘。
加1 µl 反轉錄酶（200 units）
  42℃ 孵育 50 分鐘，然后，
在70℃孵育15 分鐘 終止反應
注意：作為優化的步驟，加1 µl RNase H （2 unit/µl）
37℃ 孵育20分鐘

*輪PCR 反應：
準備以下試劑
5 µl 10x PCR 緩沖液（含或不含MgCl2）
*5 µl 25 mM MgCl2 （調整不同的MgCl2濃度,推薦終濃度 2.5 mM）
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物對 A
1 µl Taq DNA 聚合酶
2 µl cDNA 加水使體積達到50 µl
 94℃孵育 2 分鐘，變性 cDNA.
進行的15–40 個循環的 PCR.退火和延伸反應是根據引物和模板情況依經驗而確定的。

第二輪 PCR 反應
準備以下試劑
5 µl 10x PCR 緩沖液（含或不含MgCl2）
*5 µl 25 mM MgCl2 （調整不同的MgCl2濃度,推薦終濃度 2.5 mM）
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物對 B
1 µl Taq DNA 聚合酶
1–5 µl *次PCR 產物，并補加水到50 µl
94℃孵育 2 分鐘變性 cDNA.
進行的15–40 個循環的 PCR.退火和延伸反應是根據引物和模板情況依經驗而確定的。
PCR產物在瓊脂糖凝膠中，EB染色后可見。