Abbexa  abx151519說(shuō)明書(shū)

人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19(FGF19)ELISA試劑盒

 目錄號(hào)：abx151519

尺寸：96T

范圍：15.6 pg/mL-1000 pg/mL

靈敏度：< 5.7 pg/mL

儲(chǔ)存：96孔板、標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)試劑在-20 ℃下儲(chǔ)存，試劑盒的其余部分在4 ℃下儲(chǔ)存。

應(yīng)用：定量檢測(cè)人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等生物體液中的FGF19。

檢測(cè)原理：本試劑盒基于夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)。將抗體預(yù)包被在96孔板上。向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、供試品和生物素結(jié)合試劑并孵育。然后加入HRP結(jié)合試劑，并孵育整個(gè)平板。在每個(gè)階段使用洗滌緩沖液除去未結(jié)合的結(jié)合物。TMB底物用于定量HRP酶促反應(yīng)。加入TMB底物后，只有含有足量FGF19的孔才會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，然后加入酸性終止液后變?yōu)辄S色。黃色強(qiáng)度與平板上結(jié)合的FGF19量成正比。采用分光光度法在酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm處的光密度(OD)，據(jù)此計(jì)算FGF19的濃度。

試劑盒組分

• 預(yù)包被96孔微孔板：12 x 8

• 標(biāo)準(zhǔn)品：2管

• 標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液：20 mL

• 沖洗緩沖液：(30X)20 mL

• 檢測(cè)試劑A：(100X)120 μL

• 檢測(cè)試劑B：(100X)120 μL

• 稀釋劑A：12 mL

• 稀釋劑B：12 mL

• TMB底物：9 mL

• 終止液：6 mL

• 封板機(jī)：4

需要但未提供的材料

• 37 °C培養(yǎng)箱

• 多通道和單通道移液器和無(wú)菌移液器吸頭

• 噴射瓶或自動(dòng)微孔板洗板機(jī)

• 1.5 mL試管

• 蒸餾水

• 吸水性濾紙

• 100 mL和1 l量筒

• 0.01 mol/L PBS(pH 7.0-7.2)

• 酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)：450 nm）

• ELISA振蕩器

方案

A. 樣品制備

立即分析或在2-8 ℃下儲(chǔ)存樣品（24 h內(nèi)）。對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，等分并儲(chǔ)存在-20 ℃或-80 ℃下。避免多次凍融循環(huán)。

血清：應(yīng)將樣本采集至血清分離管中。將試管垂直放置在4 ℃下過(guò)夜或在室溫下靜置1 h，凝固血清。以約1000×g離心20分鐘。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。立即測(cè)定或等分并儲(chǔ)存在-20 ℃或-80 ℃下。

血漿：使用EDTA或肝素作為抗凝劑采集血漿。采集后30分鐘內(nèi)，以1000 xg離心15分鐘。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。避免使用溶血樣本。

組織勻漿：組織勻漿的制備因組織類型而異-這只是一個(gè)例子。用冰冷PBS沖洗組織，以除去過(guò)量血液。均質(zhì)化前稱重。將組織切碎，在冰上用組織勻漿器在PBS中勻漿化，并對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲處理。以5000×g離心勻漿5分鐘，收集上清液。

細(xì)胞裂解液：用胰蛋白酶分離貼壁細(xì)胞，離心收集，除去上清液。在冰冷PBS中清洗細(xì)胞3次，并在PBS中重懸細(xì)胞。超聲裂解細(xì)胞4次，或-20 ℃冷凍，解凍至室溫3次。在2-8 ℃下以1500×g離心10分鐘，除去細(xì)胞碎片。收集上清液。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液：以約1000×g離心20分鐘，除去沉淀。

其他生物液體：以約1000×g離心20分鐘，除去沉淀。立即分析或分裝并儲(chǔ)存在-20 ℃或-80 ℃下。

備注：

必須稀釋樣本，使預(yù)期濃度在試劑盒范圍內(nèi)。用0.01 mol/L PBS(PH = 7.0-7.2)稀釋樣品。

始終使用無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的采血管采集血液。

建議使用新鮮樣本或近期獲得的樣本，以防止可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的蛋白質(zhì)降解和變性。

NaN3不能用作供試品防腐劑，因?yàn)樗种艸RP。

如果手冊(cè)申請(qǐng)中未指明樣本，則需要進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)以確定試劑盒的適用性。

B. 試劑制備

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：用1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備4000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品靜置10分鐘，輕輕攪拌，然后進(jìn)行系列稀釋。避免產(chǎn)生泡沫或氣泡。進(jìn)一步稀釋4倍得到高濃度標(biāo)準(zhǔn)品1000 pg/mL。在用于系列稀釋的試管上貼上標(biāo)簽-參見(jiàn)下圖以供參考。向各試管中等分0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑緩沖液（高濃度標(biāo)準(zhǔn)品試管除外）。向第1支試管中加入0.5 mL高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，充分混勻。從第1個(gè)試管轉(zhuǎn)移0.5 mL至第2個(gè)試管，充分混勻，以此類推。

注：復(fù)溶期間不得渦旋標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)檫@會(huì)使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后，應(yīng)在15分鐘內(nèi)使用。不建議重復(fù)使用復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品。

清洗緩沖液：用蒸餾水將濃縮清洗緩沖液稀釋30倍(1/30)（即，將20 mL濃縮清洗緩沖液加入580 mL蒸餾水中）。如果在濃縮清洗緩沖液中形成晶體，則加熱至室溫并輕輕混合，直至晶體*溶解。

檢測(cè)試劑A工作溶液制備：實(shí)驗(yàn)前制備不超過(guò)15分鐘。

1. 計(jì)算所需工作溶液的總體積。

2. 用稀釋劑A將檢測(cè)試劑A稀釋100倍，充分混勻。移液器動(dòng)作緩慢、平穩(wěn)，可減少體積誤差。

檢測(cè)試劑B工作溶液制備：在實(shí)驗(yàn)前制備不超過(guò)15分鐘。

1. 計(jì)算所需工作溶液的總體積。

2. 用稀釋劑B將檢測(cè)試劑B稀釋100倍，充分混勻。移液器動(dòng)作緩慢、平穩(wěn)，可減少體積誤差。

C. 試驗(yàn)方案

按照上文所述制備所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑。使用前，將試劑盒組分和樣本平衡至室溫。建議重復(fù)測(cè)量?jī)纱危⒗L制每個(gè)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

• 在預(yù)包被板上分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、供試品孔和對(duì)照（零）孔，記錄其位置。在不接觸側(cè)壁的情況下，將溶液添加到每個(gè)孔的底部。在加入到孔中之前，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品上下吸移混勻。避免產(chǎn)生泡沫或氣泡。

2. 將100 μL稀釋標(biāo)準(zhǔn)品等分至標(biāo)準(zhǔn)品孔中。

3. 將100 μL標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液等分至對(duì)照（零）孔中。

4. 將100 μL適當(dāng)稀釋的樣品等分至供試品孔中。輕敲微孔板混勻，或使用微孔板振蕩器。

5. 用封板覆膜覆蓋微孔板，并在37 ℃下孵育1 h。

6. 取下蓋子，棄去液體。請(qǐng)勿清洗。

7. 向各孔中分裝100µl檢測(cè)試劑A工作溶液。用封板覆膜覆蓋微孔板，并在37 ℃下孵育1 h。

• 取下蓋子，棄去溶液。用清洗緩沖液清洗微孔板3次。使用多通道移液器或自動(dòng)清洗器，用清洗緩沖液(300 μL)*填充每個(gè)孔（建議浸泡1-2分鐘）。每個(gè)步驟*去除液體對(duì)于良好性能至關(guān)重要。終清洗后，通過(guò)抽吸或傾析除去任何剩余的清洗緩沖液。倒置微孔板，在干凈的吸水紙巾上吸干。

9. 向各孔中分裝100µl檢測(cè)試劑B工作溶液。密封平板，并在37 ℃下孵育30分鐘。

10. 取下蓋子，棄去溶液，重復(fù)步驟8中描述的清洗過(guò)程5次。

• 向各孔中分裝90 μL TMB底物。用封板覆膜覆蓋微孔板。輕輕敲擊微孔板使其充分混合。在37 ℃下孵育10 min。孵育時(shí)間僅供參考，終用戶應(yīng)確定宜時(shí)間。避免暴露于光照下。

12. 向各孔中分裝50µl終止液。重要的是，在整個(gè)微孔板中快速均勻地混合終止液，以*滅活酶。

13. 確保平板底部沒(méi)有指紋或水，孔中的液體無(wú)氣泡。立即測(cè)量450 nm處的OD。

計(jì)算時(shí)，取各參比標(biāo)準(zhǔn)品和各樣品的OD 450讀數(shù)的平均值，然后減去平均對(duì)照（零）OD讀數(shù)。

（相對(duì)OD）=（每個(gè)孔的OD）-（零孔的OD）

以各參比標(biāo)準(zhǔn)品溶液(X)的相對(duì)OD對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Y)的相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插樣品濃度。如果測(cè)定的樣品被稀釋，則將內(nèi)插得到的濃度乘以稀釋因子，得到稀釋前的濃度。

注意事項(xiàng)：

使用試劑盒前，離心試管，使蓋中的內(nèi)容物減少。

在兩次孵育之間，請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間暴露微孔。每個(gè)步驟的試劑添加時(shí)間不得超過(guò)10分鐘。

在孵育步驟期間，確保平板正確密封或覆蓋，并且時(shí)間和溫度受控。

請(qǐng)勿重復(fù)使用移液器槍頭和試管。

請(qǐng)勿使用過(guò)期組件或來(lái)自不同套件的組件。

TMB底物應(yīng)在無(wú)菌條件下使用，并盡量減少光暴露。未使用的底物應(yīng)為無(wú)色或淺黃色。請(qǐng)勿將任何殘留溶液丟棄回小瓶中。

請(qǐng)注意，該試劑盒經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可用于檢測(cè)天然樣本，而不是重組蛋白或合成化學(xué)品。我們無(wú)法保證重組蛋白的檢測(cè)，因?yàn)樗鼈兛赡芘c天然蛋白具有不同的序列或三級(jí)結(jié)構(gòu)。

精密度：

試驗(yàn)內(nèi)精密度（試驗(yàn)內(nèi)精密度）：3份含低、中和高水平FGF19的樣本分別在一個(gè)平板上檢測(cè)20次。

試驗(yàn)間精密度（試驗(yàn)間精密度）：在3個(gè)不同平板上檢測(cè)低、中和高水平FGF19的3份樣本，每個(gè)平板8份重復(fù)樣本。

CV(%)=（標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值）×100批內(nèi)：CV < 10%

批間：CV < 12%

D. 典型數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

提供的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅用于演示目的。必須為進(jìn)行的每次分析生成新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。