trilink基因編輯

基因組編輯已成為治療發(fā)展中令人興奮的新領(lǐng)域之一。存在多種用于基因組編輯的工具。簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）/ Cas9由于其高效和易用性，已成為受歡迎的基因組編輯工具。Cas9 mRNA與指導(dǎo)RNA的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致雙鏈斷裂，可以通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)，從而導(dǎo)致使目標(biāo)基因失活的插入缺失。如果與切割位點(diǎn)具有同源性的供體DNA模板也被共轉(zhuǎn)染，則同源性指導(dǎo)的修復(fù)可導(dǎo)致基因校正或插入。

TriLink提供了三種類型的Catalog mRNA，用于CRISPR基因組編輯。對(duì)于CRISPR / Cas9基因編輯，這些包括具有未修飾堿基的Cas9 mRNA以及經(jīng)5-甲氧基尿苷修飾以減少先天免疫應(yīng)答的Cas9 mRNA。我們還提供經(jīng)5-甲氧基尿苷修飾的Cas9切口酶。Cas9切口酶具有D10A氨基酸突變，可防止DNA鏈之一的切割。結(jié)果，Cas9切口酶產(chǎn)生單鏈切口，而不是雙鏈斷裂。DNA的切割或編輯通過(guò)約100個(gè)核苷酸的單個(gè)引導(dǎo)鏈RNA（sgRNA）定向到特定的染色體位置。CRISPR的另一種核酸酶是Cas12a。CRISPR / Cas12a基因編輯使用約42個(gè)核苷酸的RNA導(dǎo)鏈。TriLink提供未修飾的Cas12a或5-甲氧基尿苷修飾的Cas12a mRNA。 

我們的基因編輯工具中包括Cre重組酶，這是一種酪氨酸重組酶，可催化兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的重組。由于Cre介導(dǎo)的重組，兩個(gè)都包含loxP位點(diǎn)的獨(dú)立DNA物種可能發(fā)生融合事件。Cre可用于將DNA序列插入包含loxP位點(diǎn)的基因組。它也可用于細(xì)胞標(biāo)記研究，其中Cre表達(dá)激活了轉(zhuǎn)基因小鼠品系中l(wèi)oxP位點(diǎn)側(cè)翼的無(wú)活性報(bào)告基因。然后，用Cre mRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將表達(dá)報(bào)告基因，并揭示哪些細(xì)胞被高效轉(zhuǎn)染。

成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）迅速成為基因組編輯領(lǐng)域受歡迎的工具。CRISPR已被適配用于細(xì)菌抗噬菌體免疫系統(tǒng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

TriLink CRISPR工具套件包括兩個(gè)組件：一個(gè)是由Cas9或Cas12a mRNA編碼的CRISPR核酸酶，第二個(gè)是向?qū)NA。實(shí)際上，Cas9指南由CRISPR RNA（crRNA）和反式CRISPR RNA（tracrRNA）組成。為了簡(jiǎn)化和提高效力，研究人員將這兩個(gè)RNA融合為一個(gè)約100個(gè)核苷酸的單個(gè)RNA，他們將其稱為單個(gè)向?qū)NA（sgRNA）。與Cas9相比，Cas12a使用約42個(gè)核苷酸的單個(gè)引導(dǎo)RNA。

當(dāng)將Cas9或Cas12a mRNA和sgRNA共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時(shí)，引導(dǎo)鏈將Cas9或Cas12a蛋白導(dǎo)向基因組中的特定位置，然后在Cas9中產(chǎn)生雙鏈斷裂。Cas9切口酶mRNA編碼具有D10A突變的Cas9，該突變導(dǎo)致單鏈切口而不是雙鏈斷裂。這可能導(dǎo)致較少的脫靶效應(yīng)。

嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞已被用作血液腫瘤臨床治療的過(guò)繼性T細(xì)胞療法（ACT）免疫療法之一。近，它們也已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)體瘤。

通常對(duì)CAR構(gòu)建體進(jìn)行修飾，使其包含單鏈抗體片段（scFv）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，以及通過(guò)獨(dú)立于主要組織相容性復(fù)合物（MHC）的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域激活T細(xì)胞的能力。修飾的T細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)CAR，其在治療期間識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原。

從要治療的患者中收集大多數(shù)CAR T細(xì)胞的原始材料（自體移植）。擴(kuò)增并修飾收獲的細(xì)胞以表達(dá)CAR。CRISPR通常用于在TRAC（T細(xì)胞受體α常數(shù)）位點(diǎn)特異性插入位點(diǎn)，取代內(nèi)源性T細(xì)胞受體。自體移植可避免排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病，但這些細(xì)胞通常來(lái)自病情較重的患者，因此效力可能不及健康供體所收集的細(xì)胞。另一種通用的現(xiàn)成解決方案是使用來(lái)自健康，同種異體供體的修飾細(xì)胞。這提供了一種途徑來(lái)克服高昂的成本，一定程度地減少制造復(fù)雜性，縮短治療時(shí)間并解決患者健康和生物安全問(wèn)題。

然而，為了防止這些外源細(xì)胞的排斥，需要通過(guò)CRISPR進(jìn)行廣泛的基因缺失。CRISPR-Cas工程提供了下一代CAR T細(xì)胞解決方案，可以沉默或破壞任何所需的基因組基因座，使移植物抗宿主病（GvHD）和排斥反應(yīng)小化，敲除檢查點(diǎn)受體，增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)等。今天的CRISPR-Cas工程CAR T細(xì)胞在治療感染性疾病，自身免疫性疾病和提高移植耐受性方面具有治療潛力。

TriLink為CRISPR提供了幾種未經(jīng)修飾或經(jīng)5-甲氧基尿苷（5moU）修飾的mRNA，以減少先天免疫應(yīng)答。在該領(lǐng)域*的研究人員的幫助下，這些序列已進(jìn)行了序列優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)良好表達(dá)。TriLink還生產(chǎn)鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶（TALEN）mRNA，用于生產(chǎn)CAR T細(xì)胞療法。當(dāng)您準(zhǔn)備將研究成果轉(zhuǎn)移到臨床時(shí)，TriLink會(huì)在我們的cGMP設(shè)施中提供GMP合成的導(dǎo)鏈和核酸酶mRNA。

重組酶

位點(diǎn)特異性重組酶是用于操縱基因組以及有條件地激活或去激活細(xì)胞和生物體中基因表達(dá)的有用工具。重組酶識(shí)別約30-40個(gè)核苷酸的短目標(biāo)DNA序列，并催化定向DNA交換反應(yīng)。由于識(shí)別位點(diǎn)在高等生物的基因組中并不常見(jiàn)，因此可以用作工程改造基因組的工具。然而，重組酶在細(xì)胞或體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致毒性和不合需要的脫靶重組。因此，mRNA的瞬時(shí)表達(dá)是重組酶表達(dá)的理想方法。

常用的重組酶之一是Cre重組酶。我們CleanCap ® NLS-Cre重組酶基因是一個(gè)上限（第1章）和聚腺苷酸化信使RNA，編碼Cre重組酶融合到核定位序列（NLS）。Cre重組酶是衍生自P1噬菌體的酪氨酸重組酶。Cre催化兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的重組，這些位點(diǎn)由一個(gè)34個(gè)堿基對(duì)的識(shí)別位點(diǎn)（5'ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT 3'）組成。Cre重組酶已被廣泛用于操縱植物，細(xì)菌，酵母和哺乳動(dòng)物中的DNA。根據(jù)loxP位點(diǎn)的方向，Cre可用于誘導(dǎo)DNA盒交換，切除/插入，倒位和易位。

NLS-Cre重組酶mRNA的應(yīng)用包括創(chuàng)建敲除或敲入動(dòng)物，組織特異性蛋白表達(dá)以及標(biāo)記研究，這些研究報(bào)道了將mRNA遞送至給定細(xì)胞類型。Cre重組酶mRNA也是評(píng)估體外和體內(nèi) mRNA遞送效力的有用工具。

人才

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）已經(jīng)成為鋅指核酸酶（ZFN）的一種更容易獲得的替代物。像ZFN一樣，TALENs利用模塊化的DNA結(jié)合基序，可以對(duì)其進(jìn)行修飾以引入新的DNA結(jié)合特異性。與ZFN不同，TALEN不太容易使從頭設(shè)計(jì)復(fù)雜化的序列上下文效應(yīng)，使它們成為普通科學(xué)界更實(shí)用的工具。TriLink自定義mRNA轉(zhuǎn)錄服務(wù)包括TALEN mRNA。TALEN由多個(gè)重復(fù)可變雙殘基（RVD）組成，每個(gè)重復(fù)殘基與單個(gè)核苷酸結(jié)合。通過(guò)以特定順序?qū)VD串在一起制成TALEN陣列，以提供對(duì)新型DNA序列的特異性和結(jié)合親和力。通常，工程化的TALEN序列與非特異性切割結(jié)構(gòu)域融合，例如FokI。與ZFN一樣，TALEN充當(dāng)與相鄰DNA序列結(jié)合的對(duì)。TriLink提供了mRNA表達(dá)載體，旨在輕松接受使用Golden Gate方法克隆的TALEN。

轉(zhuǎn)座酶

轉(zhuǎn)座酶是一種以非常準(zhǔn)確的方式催化轉(zhuǎn)座子（DNA元件）從基因組中的一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置的酶。轉(zhuǎn)座子廣泛存在于人類基因組中，并可能導(dǎo)致多達(dá)40％的基因組重排。轉(zhuǎn)座酶是將外源序列插入靶基因組的早可用工具之一。通常，用于轉(zhuǎn)移的序列在轉(zhuǎn)座子盒中側(cè)接反向末端重復(fù)序列。當(dāng)轉(zhuǎn)座子盒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)座酶催化轉(zhuǎn)座子的切除及其插入細(xì)胞染色體中。兩種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座酶/轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Sleeping Beauty和PiggyBac。睡美人轉(zhuǎn)座子整合到基因組的TA序列中，